Лаборатория биофизических методов диагностики

Области научных интересов

Области научных интересов

Направление исследований лаборатории – «Разработка новых методов клинической диагностики на основе молекулярных флуоресцентных зондов».
Базовая идея этого подхода состоит в регистрации изменений физических свойств компонентов крови - клеток и белков плазмы - при патологических процессах. Эти изменения регистрируются с помощью специально синтезированных небольших органических молекул – так называемых молекулярных зондов. Зонды при добавлении в кровь специфически связываются с тем или иным белком или клетками, и при этом интенсивность и спектры флуоресценции зонда значительно изменяются в зависимости от физических свойств белка/клетки. С помощью таких молекулярных флуоресцентных зондов удалось обнаружить изменения физических параметров белков и клеток крови при ряде патологических процессов.

Основные научные направления

Развитие теории метода флуоресцентных зондов
Зонды весьма чувствительны к малейшим изменениям окружающей их среды (белка или липида, с которым зонд связан). На этом основаны методы их использования. Однако полное физическое описание поведения зонда, а также интерпретация получаемых флуоресцентных измерительных данных невозможны без разработки соответствующих физических моделей и развития соответствующих вычислительных методов. Для того чтобы использовать зонды в исследовании пространственной структуры мембран и липопротеинов, потребовалось создание математических моделей безызлучательного переноса энергии между зондами и белками (Г.Е.Добрецов, О.В.Чекрыгин, Н.К.Курек). Так было установлено расположение белков в ЛНП (М.М.Спирин), ЛОНП (Е.Н.Лапшин, Н.К.Курек) и дискоидальных ЛВП (А.Д.Дергунов).
Когда зонд связывается с липидами, молекулой альбумина и тем более с таким сложным объектом как живая клетка, разные молекулы зонда оказываются в различном окружении и, соответственно, флуоресцируют по-разному. Чтобы разобраться в этой гетерогенной ситуации, была использована техника измерений затухания флуоресценции в диапазоне времен 10–11 –10–8 секунд. Cпециальные опыты на липидных мембранах и липопротеинах позволили понять события, которые разворачиваются в липиде, окружающем зонд (В.Ю.Светличный). При связывании с альбумином зонд занимает несколько специальных мест («центров»); по затуханию флуоресценции впервые удалось одновременно наблюдать за состоянием разных центров, а также проследить за их изменениями при патологических процессах (Т.И.Сырейщикова, М.Н.Комарова, Ю.А.Грызунов, Н.В.Смолина), однако для этого пришлось разработать метод определения концентрации флуоресцирующих молекул по параметрам затухания флуоресценции, а также метод оценки подвижности молекул зонда в таких гетерогенных средах как молекула альбумина (Г.Е.Добрецов, Т.И.Сырейщикова).
В последние годы большое внимание в лаборатории было уделено пониманию физических причин влияния окружающей зонд среды на его флуоресценцию. Были проведены серии модельных опытов, включая переходные спектры поглощения с временным разрешением 10–13 секунд, и проведен анализ результатов с позиций теории сдвигов спектров (проф. Н.Г.Бахшиев, Санкт-Петербургский университет). Получены оригинальные результаты о механизмах сольватации зонда окружающей средой (С.К.Гуларян).
Особо следует отметить создание многопроцессорного кластера для квантово-химических расчетов электронной структуры и оптических свойств молекул зондов в их взаимодействии с окружающей средой (С.К.Гуларян, Б.М.Поляк). Расчеты такого уровня молекул флуоресцентных зондов никем ранее не проводились. Полученные в последнее время результаты позволяют понять, почему зонд обладает такой флуоресценцией и почему он так реагирует на окружающую его среду; эти вопросы по отношению к флуоресценции трудно разрешимы

lbfmd06Квантово-химический расчет, показывающий причину изменения интенсивности флуоресценции зонда ДМХ при изменении полярности среды.
На схеме показаны нижние электронные уровни молекулы зонда ДМХ. GS — уровень основного состояния, выше расположены уровни синглетных и триплетного возбужденных состояний.
В неполярных средах (например, в липидных мембранах или в липопротеинах) переход из синглетного состояния 1(п,п ) через 1(n,п ) в триплетное состояние З(п,п ) приводит к тушению флуоресценции. В полярных средах этого не происходит.

Альбуминовый флуоресцентный тест.

lbfmd01
Молекула альбумина в крови транспортирует малые органические молекулы и имеет для их связывания специальные центры. Поэтому альбумин является активным элементом механизма доставки жирных кислот как источника энергии - к мышцам, токсичных метаболитов – к органам детоксикации, важным элементом метаболизма лекарств и т.д. Связывающие центры изменяются при патологии, однако эта информация ранее не использовалась в клинической диагностике. Для исследования этих центров в лаборатории был создан флуоресцентный зонд К-35 (Р.К.Айдыралиев, Ю.И.Миллер, Ю.А.Грызунов), который при добавлении в цельную плазму крови занимает альбуминовые связывающие центры (Рис.). При этом практически вся флуоресценция обусловлена зондом, связанным с альбумином (М.Н.Комарова, Н.В.Смолина). Зонд К-35 был синтезирован в лаборатории проф. Б.М.Красовицкого (институт монокристаллов, г.Харьков, Украина).

Для клинических исследований диагностических возможностей этого подхода были разработаны и выпущены опытные партии наборов реактивов. Исследования, проведенные более чем в 60 клиниках, показали, что альбуминовый флуоресцентный тест эффективен при раннем (в первые сутки) прогнозе развития перитонита (многоцентровое исследование с участием проф. А.А.Гринберга и проф. Г.В.Родомана, РГМУ; проф. А.М.Федоровского, ММА; проф. В.Г.Мусселиуса, институт скорой помощи им. Склифосовского, и др.), в диференциальном диагнозе, оценке тяжести и прогнозе развития острого панкреатита (проф. Г.В.Родоман, Т.И.Шалаева, РГМУ), в прогнозе острых отравлений психотропными препаратами (проф. К.К.Ильяшенко, институт скорой помощи им. Склифосовского; Е.Д.Сыромятникова), значительно превосходя в этом отношении другие лабораторные показатели крови.
Интересные результаты получены при стрессе (акад. К.В.Судаков, Е.В.Коплик, институт нормальной физиологии РАМН) и психических расстройствах (проф.М.Г.Узбеков, Э.Ю.Мисионжник, Московский НИИ психиатрии; Н.В.Смолина), эта линия исследований была поддержана международным грантом и грантом Президиума РАН.
Молекула альбумина имеет также тиоловую группу –SH, которая может окисляться/восстанавливаться и тем самым влиять на оксидативные процессы в крови. Изменения этой группы при патологии исследуются лабораторией (Н.В.Смолина, В.В.Калинина, Е.Д.Сыромятникова) совместно с лабораторией проф. О.А.Азизовой; получены предварительные диагностически значимые результаты.

Поиск диагностически значимых молекулярных показателей в плазме крови и в раневом экссудате при термических ожогах.

Исследование и тестирование клеточных мембран и липопротеинов крови.

Концентрации и свойства липопротеинов плазмы крови, как известно, коррелируют с развитием атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний (Рис.). Регулярное определение в крови наиболее атерогенных липопротеинов – низкой плотности (ЛНП) и очень низкой плотности (ЛОНП) - считается обязательным в программах профилактики этих заболеваний. Обычно их измеряют ферментативными методами. По инициативе академика Ю.М.Лопухина в нашей лаборатории был разработан флуоресцентный экспресс-метод оценки содержания этих липопротеинов в микроколичествах плазмы крови для массовых обследований населения (Е.Н.Лапшин, Н.К.Курек, А.Н.Рухтин), а также клинические флуориметры и наборы реактивов для данного анализа. Метод позволяет измерять липопротеины быстро (секунды) и дешево.

lbfmd02

Метод основан на применении специального флуоресцентного зонда К-37 (проф. Б.М.Красовицкий, В.Т.Скрипкина), который при добавлении в плазму крови флуоресцирует в основном из гидрофобного липидного ядра липопротеинов.
Для исследования физической структуры липопротеинов были использованы разнообразные варианты флуоресцентного зондирования с использованием безызлучательного переноса энергии между зондами (М.М.Спирин, Е.Н.Лапшин, Н.К.Курек), кинетической флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением до 50 пикосекунд (Т.И.Сырейщикова, М.Н.Якименко, физический институт РАН). В результате была установлена пространственная структура белковой части ЛНП и ЛОНП (М.М.Спирин, Е.Н.Лапшин, Н.К.Курек), а затем и дискоидальных липопротеинов высокой плотности (А.Д.Дергунов) (Рис.), а также множественно модифицированных ЛНП, характерных для атеросклероза (А.С.Орехов, О.М.Панасенко, С.К.Гуларян).

lbfmd03

С помощью флуоресцентных зондов были предприняты попытки найти липопротеиноподобные частицы и в лейкоцитах (С.К.Гуларян). Полученные данные указывают на возможность существования таких частиц в гранулоцитах, тогда как в лимфоцитах их не обнаружено. Исследование внутриклеточных липидов проводилось совместно с институтом химической физики РАН (проф. О.М.Саркисов) на флуоресцентных микроскопах с двухфотонным возбуждением, позволяющих регистрировать спектр и пикосекундное затухание флуоресценции в любой точке живой клетки. На рисунке показана клетка HeLa, прижизненно окрашенная флуоресцентным зондом ДМХ, предложенным проф. Ю.А.Владимировым. ДМХ связывается с липидными структурами. В левой части рисунка показан вид клетки в микроскопе. Затем в каждом участке клетки размером около 0,4 мкм измеряется спектр и затухание флуоресценции зонда. Оказывается, что физическая структура разных участков клетки не одинакова. По совокупности параметров «спектр+затухание» выделяются зоны клетки (показаны условными цветами на правом рисунке), различающиеся структурной организацией липид-белковых комплексов (С.К.Гуларян, В.Ю.Светличный). Этот подход может быть использован для поиска нарушений липидных структур клетки при патологических процессах.

lbfmd04

Электрические поля клеток крови и их изменения при патологических процессах.

С помощью флуоресцентных зондов в лаборатории были впервые измерены потенциалы одновременно двух электрических полей – на плазматической и митохондриальной мембранах – в лимфоцитах крови (Г.И.Морозова, В.В.Косников). Потенциалы электрических полей на плазматической и внутренней митохондриальной мембранах лимфоцита, измеренные этим методом, показаны на рисунке.

Дальнейшие исследования показали, что потенциалы этих электрических полей весьма чувствительны к аллергическим заболеваниям, и их измерение может быть использовано для тестирования аллергена, к которому чувствителен пациент (В.В.Косников; проф. В.А.Фрадкин, институт контроля вирусных препаратов), причем в отличие от кожных проб, проводимых на самом пациенте, флуоресцентный анализ проводится в крови вне тела.
Электрические поля изменяются также при бронхиальной астме (проф. Н.А.Дидковский, НИИ ФХМ). Электрические поля лимфоцитов реагируют на опухолеассоциированные антигены и на известный терапевтический препарат - иммуномодулятор Тактивин (проф. В.Я.Арион, О.В.Белова, НИИ ФХМ).
Таким образом, измерение электрических полей клеток крови - новый источник информации о состоянии иммунокомпетентных клеток при иммунологических заболеваниях, который требует дальнейшей разработки.

lbfmd05

Разработка биохимических и биофизических методов оценки состояния и диагностики волос

Цель исследований: разработка биохимических и биофизических методов оценки состояния и диагностики волос

Волос человека – это своеобразный мини-орган, состоящий из фолликула и стержня. Клетки фолликула обеспечивают синтез стержня волоса, так что по интенсивности синтеза белка волосяные фолликулы находятся на одном из первых мест в организме.

Синтез белков-кератинов, деление клеток фолликула, их нормальный метаболизм зависят от энергетических ресурсов.

АТФ – это не только источник энергии для жизни клеток, но и важный регулятор процессов, протекающих в волосяных фолликулах. Поэтому резкие отклонения в содержании АТФ могут повлечь за собой нарушение цикла развития волоса, сокращение периода активного роста, преждевременное выпадение (алопеция).

Сам стержень волоса подвержен воздействию различных факторов внешней среды: его могут повреждать ультрафиолет, сорбирующиеся ионы металлов, химическая завивка и отбеливание. В результате нарушается проницаемость внешнего защитного слоя стержня волоса – кутикулы, и возрастает лабильность белков внутреннего слоя – кортекса.
Уже известно, что при химической завивке и при отбеливании волос потеря им белков возрастает.

lbfmd07

На схеме представлено условное изображение белков, составляющих стержень волоса: оранжевые и зеленые фигуры обозначают легкие кератины, растворимые в воде. Тяжелые и легкие кератины могут быть связаны ковалентно. При разрушении межбелковых связей (например, дисульфидных мостиков S-S) количество свободных растворимых белков в стержне волоса увеличивается. При попадании волоса в водную среду часть легких кератинов удерживается внутри стержня волоса (оранжевые фигуры), а другая часть проникает через кутикулу и с помощью биохимических и биофизических методов обнаруживается в водной среде вне волоса.

Мы попытались ответить на следующие вопросы:

  • возможна ли оценка содержания АТФ в оболочках луковицы вырванного волоса?
  • есть ли изменения в уровне содержания АТФ у пациентов с выпадением волос по сравнению со здоровыми добровольцами и между разными зонами волосистой части головы?
  • изменяется ли лабильность белков стержня волос у пациентов с алопецией по сравнению со здоровыми добровольцами и в зависимости от зоны волосистой части головы?

Мы обследовали пациентов с андроген-зависимым и телогеновым типом выпадения волос, и уже можно сказать, что наибольшие сдвиги в измеряемых показателях отмечаются при андроген-зависимом выпадении волос. Например, у таких пациентов часто отмечаются существенные различия по содержанию АТФ между зоной темени и затылка, а утечка белков из волос в зоне темени часто превышает показатели для здоровых добровольцев и для волос из зоны затылка.

Для проведения анализа требуется всего лишь по 5 волос из каждой из обследуемых зон головы. По результатам анализа мы можем судить о средней скорости утечки белков в стандартных лабораторных условиях и сопоставлять результат с данными для здоровых добровольцев.
На основании полученных данных можно говорить о степени повреждения белков стержня волоса и о необходимости применять специальные защитные и укрепляющие средства.