Отдел молекулярной биологии и генетики
ХИРАЛЬНЫЕ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПНК НА ОСНОВЕ L-GLU: СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ
Кириллова Ю.Г., Танкевич М.В., Варижук А.В., Смирнов И.П., Позмогова Г.Е.
Лаборатория искусственного антителогенеза
Пептидно-нуклеиновые кислоты (PNAs) - функциональные аналоги нуклеиновых кислот, сохраняющие способность к гибридизации с РНК/ДНК-мишенями. К настоящему времени PNAs и их производные как биостабильные и мембранотропные миметики олигонуклеотидов находят применение в молекулярной медицине для исследований в области геномики, разработки новых диагностических и геннотерапевтических подходов. Среди различных модификаций классических аминоэтилглициновых (aeg) PNAs наиболее перспективными признаны ациклические γ-производные. Такие хиральные ПНК имеют преорганизованную вторичную структуру. Введение функциональных групп в боковой радикал PNAs позволяет модулировать их свойства. В настоящей работе для снижения токсичности PNAs мономеры несли отрицательный заряд. Синтез состоял из следующих основных этапов: (I) синтез псевдопептида; (II) синтез мономера; (III) -олигомеризация мономеров на твердой фазе.
Были получены оригинальные α- и γ-мономеры на основе L-Glu, а также описанные ранее γ-мономеры на основе L-Ala и aeg-мономеры, а также оптимизированы методы их олигомеризации. Впервые определена природа структурных перестроек αPNA, получен ряд полианионных олигомеров PNAs, изучены их гибридизационные свойства, показаны преимущества при формировании комплементарных связей миметиков с чередованием мономеров на основе L-Glu и aeg-мономеров. Материалы работы в 2014 г. доложены на XXI Round Table on Chemical Biology of Nucleic Acids и конференции FEBS, 2 статьи в печати.
АНАЛИЗ ГЕНОМОВ E. COLI, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ БОЛЬНЫХ БОЛЕЗНЬЮ КРОНА
Ракитина Д.В., Байкова Ю.П, Ладыгина В.Г., Кострюкова Е.С., Семашко Т.А., Карпова И.Ю., Бабенко В.В., Манолов А.И., Каныгина А.В, Алексеев Д.Г., Щербаков П.Л.
Лаборатория протеомного анализа, лаборатория постгеномных исследований в биологии, лаборатория биоинформатики
Болезнь Крона (БК) – гранулематозный энтерит, генерализованное воспаление кишечного тракта. Один из возможных механизмов развития БК предполагает активное участие E. coli, выделяемых в особую группу «адгезивно-инвазивных». Данные о составе этой группы довольно противоречивы. Методами генотипирования, серотипирования, мультилокусного ПЦР и сравнительной гибридизации геномов показано значительное разнообразие E. coli, изолированных от пациентов с БК (БК-E. coli). Показана их принадлежность к филогруппам А, В1, В2 и D. В то же время все 4 опубликованные на настоящий момент генома БК-E. coli, полученных методом полногеномного шотган-секвенирования, относятся к группе В2 и крайне близки друг к другу в хромосомной части геномов, что позволяет выдвигать гипотезы о филогенетическом родстве БК-E. coli и рассматривать их как эволюционно целостную группу патогенов. Для прояснения этого вопроса нами было впервые в мире предпринято масштабное полногеномное секвенирование БК-E. coli (21 изолят от 7 пациентов). Сравнительный анализ полученных геномов показал, что полученные нами изоляты филогенетически гетерогенны (относятся к группам А, В1, В2 и D). В то же время в предполагаемых плазмидных участках полученных геномов обнаружены элементы сходства.
ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДЕСТАБИЛАЗЫ II МЕДИЦИНСКОЙ ПИЯВКИ В РАЗЛИЧНЫХ СИСТЕМАХ ЭКСПРЕССИИ
Манувера В.А., Курдюмов А.С., Лазарев В.Н.
Лаборатория генной инженерии
Дестабилаза медицинской пиявки (Hirudo medicinalis) — полифункциональный лизоцим беспозвоночных (Баскова и Никонов, 1985). Данный фермент сочетает лизоцимную (КФ 3.2.1.17) и эндо-ε-(γ-Glu)-Lys-изопептидазную (КФ 3.5.1.44) активности. Действие фермента направлено на растворение стабилизированного фибрина (Баскова и Никонов, 1991). В экспериментах на животных установлено, что под воздействием дестабилазы происходит разрушение старых тромбов (Baskova and Nikonov, 1991). К настоящему моменту описан только способ получения дестабилазы путем рефолдинга из телец включения E.coli. При этом, ввиду того, что из нативного секрета слюнных желез пиявки удалось выделить лишь «дестабилазный комплекс» (Nikonov and Titova, 1999), а не чистый фермент, не было возможности сравнить ферментативную активность рекомбинантного белка с природным. Вследствие этого, имелись сомнения относительно корректности пространственной структуры рекомбинантного белка, которые получили своё подтверждение в процессе нашей работы. Мы получили рекомбинантную дестабилазу, изоформы II, путем экспрессии кодирующего ее гена в бактериях Escherichia coli, дрожжах Pichia pastoris и культуре клеток человека Expi293. В случае E.coli, мы получили как полипептид в тельцах включения, в дальнейшем подвергнутый ренатурации, так и растворимую дестабилазу в виде слитого белка с шапероном SlyD, который впоследствии отщепляли специфичной TEV-протеиназой. В культурах P.pastoris и клеток человека дестабилаза накапливалась в растворимом виде в культуральной жидкости. Для полученных белков определялись лизоцимная и изопептидазная ферментативные активности. Их сравнение показало, что все растворимые формы рекомбинантной дестабилазы имеют сходную лизоцимную активность и на порядок превосходят по активности дестабилазу, полученную из телец включения. Сходное различие, хотя и не так сильно выраженное наблюдается и для изопептидазной активности. Таким образом, рекомбинантная дестабилаза II получена с использованием трех различных систем экспрессии. Показано, что данный фермент при накоплении в растворимой форме имеет значительно большую активность по сравнению с белком, полученным путем рефолдинга из телец включения. Существенного различия в активности растворимой дестабилазы, полученной в E.coli, дрожжах и клетках человека, не наблюдается. Ввиду своей способности растворять застарелые тромбы, дестабилаза вызывает интерес в качестве потенциального тромболитического агента. Получение рекомбинантной высокоактивной дестабилазы открывает возможность дальнейших работ в данном направлении.
Изоляция одиночных клеток, зараженных Chlamydia trachomatis, с помощью лазерной микродиссекции
Подгорный О.В., Полина Н.Ф., Бабенко В.В., Кострюкова Е.С., Лазарев В.Н.
Лаборатория генной инженерии; лаборатория постгеномных исследований в биологии
До недавнего времени изучение генетических основ паразитизма Сhlamydia trachomatis было весьма ограничено благодаря их уникальному двухфазному жизненному циклу, существенно усложняющему проведение генетических манипуляций. Эти бактерии обладают уникальным набором генов, которые не имеют аналогов у других видов микроорганизмов, что исключает проведение сравнительного генетического анализа с целью установления их возможной функциональной роли. В последние 5 лет были сделаны существенные шаги в направлении генетической модификации С. trachomatis. Однако ощутимым ограничением применения подходов к генетической модификации является отсутствие быстрых методов изоляции и селекции трансформантов. В этой связи в нашей работе мы впервые использовали метод лазерной микродиссекции для изоляции живых одиночных клеток, зараженных С. trachomatis, для последующего рекультивирования бактерий, происходящих из одного включения. Для прижизненной визуализации включений в зараженных клетках мы использовали флуоресцентный краситель BODIPY® FL C5-ceramide, который путем внутриклеточного транспорта переносится от аппарата Гольджи во включения. Зараженные клетки изолировались с помощью метода лазерной микродиссекции и помещались на стерильный монослой эукариотических клеток для последующего рекультивирования. Через 5-7 дней после заражения, мы с помощью антител против хламидийного липоолигосахарида обнаружили рост вторичных включений в монослое. Таким образом, метод лазерной микродиссекции может быть использован как быстрый способ изоляции живых одиночных клеток, зараженных С. trachomatis. Кроме того, в нашей работе мы применили полногеномное секвенирование к таким одиночным изолированным клеткам, чтобы оценить генетическую вариабельность С. trachomatis, которые происходят из одного включения.
СОЗДАНИЕ РЕПОРТЕРНОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ СКРИНИНГА ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ, ОСНОВАННОЙ НА АНАЛИЗЕ АКТИВНОСТИ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ
Широков Д.А., Манувера В.А., Полина Н.Ф., Бобровский П.А., Лазарев В.Н.
Лаборатория генной инженерии
Создание чувствительных биосенсоров для оценки биологической активности и токсичности разрабатываемых медицинских препаратов является одной из актуальных проблем современной биотехнологии. Развитие в последние годы системного подхода в молекулярно-биологических исследованиях диктует необходимость комплексного анализа эффектов, оказываемых на эукариотическую клетку исследуемым веществом. Одним из вариантов такого системного подхода является анализ транскрипционных факторов, активируемых либо ингибируемых в клетке в ответ на внеклеточный сигнал. В нашей лаборатории разработана репортерная система, позволяющая оценивать воздействие различных веществ на транскрипционные факторы в эукариотической клетке. Система включает в себя генно-инженерные конструкции, содержащие химерный ген стрептавидин-пептид-GFP под контролем позднего аденовирусного промотера MLP-Ad5 и сайтов связывания различных транскрипционных факторов. Культуры эукариотических клеток, трансфицированные такими векторами, становятся удобными биосенсорами для анализа исследуемого вещества. Продукт химерного гена, синтезируемый клетками, позволяет провести качественный и количественный анализ экспрессии того или иного транскрипционного фактора. Для качественного анализа используется GFP-часть химерного белка, детектируемая методами конфокальной микроскопии либо чувствительными иммунологическими методиками. Количественный анализ возможен при определении пептидной части с помощью методов масс-спектрометрии. Использование библиотеки протеотипических пептидов, каждый из которых обладает однозначно идентифицируемым спектром в масс-спектрометрическом исследовании, позволит проводить мультиплексный анализ одновременно множества транскрипционных факторов. Наконец, стрептавидиновая часть может служить для очистки химерного белка с помощью аффинной хроматографии. Стоит отметить, что данная система может найти применение не только в прикладных исследованиях при проверке биобезопасности новых веществ, используемых в медицине, косметологии и питании, но и в фундаментальных научных работах при изучении сигнальных путей в эукариотической клетке.
НОВЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СПОРТИВНОЙ УСПЕШНОСТИ. АССОЦИАЦИЯ ГЕННОГО ПОЛИМОРФИЗМА AGTR2 СО СТРУКТУРОЙ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН, АТЛЕТИЧЕСКИМ СТАТУСОМ И АЭРОБНОЙ НАГРУЗКОЙ
Генерозов Э.В., Кулемин Н.А., Ищенко Д.С., Ахметов И.И.
Лаборатория молекулярной генетики человека
На сегодняшний день хорошо известен факт индивидуальных различий у человека, ассоциированных с лучшими или худшими способностями выполнять физическую работу с аэробной или анаэробной нагрузкой. И, по крайней мере, частично эти различия объясняются интериндивидуальной вариабельностью состава мышечных волокон. Гены ренин-ангиотензин-альдостероновая системы (РААС) играют ключевую роль во многих физиологических и патофизиологических процессах в организме и, как показано ранее, участвуют в процессе роста и дифференциации скелетных мышц. В ходе проведенного исследования на первом этапе была проанализирована ассоциация группы из 15 кандидатных нуклеотидных полиморфизмов с составом мышечных волокон латеральной широкой мышцы бедра. Наиболее достоверная ассоциация была показана для полиморфизма rs11091046 гена рецептора 2 типа ангиотензина II (AGTR2), вариант С которого ассоциирован с медленным типом мышечных волокон. Далее, в формате развернутого ассоциативного генетического исследования найденная ассоциация была подтверждена в группе профессиональных спортсменов, отличающихся по параметрам преобладающей физической нагрузки и спортивной успешности (n=2178) и группы контроля (n=1220). Дополнительно к этому была найдена ассоциация указанного полиморфизма с показателями потребления кислорода в ходе эргоспирометрического тестирования группы элитных спортсменов (n=44). В совокупности, полученные данные, свидетельствуют о том, что вариант С полиморфизма rs11091046 ассоциирован с увеличенной долей мышечных волокон медленного типа, показателями выносливости и показателями аэробной нагрузки. Полученные в ходе исследования данные дополняют наши знания об особенностях функционировании мышечной ткани в различных физиологических условиях.
АЛГОРИТМ ПОИСКА АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕН С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ ДАННЫХ
Ищенко Д.С., Алтухов И.А., Алексеев Д.Г.
Лаборатория биоинформатики
В работе предлагается подход к анализу масс-спектрометрической информации, позволяющий определять аминокислотные замены и пост-трансляционные модификации. В основе сравнения спектров лежит представление последних в виде векторов и вычисление угла между ними. Поиск аминокислотных замен проводится с помощью конструирования спектральной библиотеки, аннотации масс-спектрометрических пиков, определению разностей масс родительских йонов и последующему преобразованию пиков, соответствующих дочерним йонам. Была проведена валидация алгоритма с исползьованием масс-спектрометрических данных E.coli, H.pylori, N.gonorrhoeae.
ПОИСК МАРКЕРОВ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS МЕТОДАМИ СРАВНИТЕЛЬНОЙ ГЕНОМИКИ
Шитиков Е.А., Ищенко Д.С., Беспятых Ю.А., Ильина Е.Н.
Лаборатория молекулярной генетики микроорганизмов
Туберкулез, вызываемый M. tuberculosis (MTB), является одной из значимых проблем здравоохранения и социального развития страны. В последние годы шло интенсивное накопление информации о генетических механизмах устойчивости патогена к противотуберкулезным препаратам, однако в ряде случаев так и не удается установить причины резистентности. Цель представленного исследования заключалась в поиске новых маркеров лекарственной устойчивости MTB в ходе сравнительного анализа геномных данных. Для построения гипотез формирования лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам (ПТП) был проведен анализ геномов 100 охарактеризованных штаммов MTB. Выборка включала 54 образца, полногеномное секвенирование которых было проведено в ходе исследования, а также 46 образцов, загруженных из базы данных NCBI. Для вычисления вероятности ассоциации мутаций с устойчивостью был использован тест на основе гипергеометрического распределения. В ходе исследования из общего массива 6403 SNPs было выявлено 104 SNPs в генах и 12 SNPs в межгенных участках (p<0.05). Для дальнейшей проверки значимости полученных полиморфизмов была использована логистическая регрессия. Согласно анализу было получено 22 и 2 значимые мутации в генах и межгенных участках (p<0.05), ассоциированные с устойчивостью к конкретному ПТП. Таким образом, методами сравнительной геномики для российской популяции патогена удалось идентифицировать как известные детерминанты устойчивости, так новые маркеры, роль которых предстоит выяснить в будущем.
МЕТАГЕНОМНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ И ЭКОЛОГИЯ МИКРОБИОМА КИШЕЧНИКА ЧЕЛОВЕКА
Коварский Б.А., Тяхт А.В., Попенко А.С., Алексеев Д.Г.
Лаборатория биоинформатики
Микробиом кишечника человека - сложно устроенное микробное сообщество. Детальное знание таксомического состава такого сообщества не позволяет в полной мере понять его функции и те изменения, которые происходят в микробиоме под воздействием внешних факторов. Поэтому в нашем исследовании мы делаем акцент на анализе событий происходящих на уровне геномов основных “игроков” в кишечном микробиоме. Нами были обобщены полногеномные данные четырех масштабных метагеномных исследований кишечной микробиоты человека. На основе референтных последовательностей и данных по их покрытию ридами были получены кор-геномы бактериальных видов. Данные по нуклеотидным полиморфизмам были использованы для построения филогентических расстояний для кор-генов. Участки генома не входящие в кор-геном были рассмотрена в контексте выпадения и переноса генов. Расстояния по выпадению генов было сравнено с расстоянием по полиморфизмам, что позволило отделить события недавнего и более древнего появления/исчезновения генов. Для генов перепокрытых в референсных геномых была выдвинута идея об их широком горизонтальном переносе между видами и они были рассмотренны как отдельный класс. Сравнение филогенетических расстояний с географией образцов, в группе временных точек или различных отделах кишечника позволяет нам говорить о существованиии видо-специфичных законов расселения микроорганизмов, входящих в состав микробиома кишечника человека. Мы предполагаем, что наблюдаемые нами закономерности связаны с особенностями заселения кишечника и переносом микроорганизмов между людьми, а также с возможностями сожительства разных форм одного и того же вида в разных отделах одного кишечника.
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ТРАНСКРИПТОМА АКТИНИИ CNIDOPUS JAPONICUS
Бабенко В.В., Аниканов Н.А., Ковальчук С.И., Миков А.Н., Козлов С.А., Кострюкова Е.С., Лазарев В.Н.
Лаборатория постгеномных методов анализа в биологии; лаборатория протеомного анализа; лаборатория генной инженерии
Изучение морских организмов, способных продуцировать яд, имеет большое значение для открытия новых лекарственных препаратов, пищевых добавок и промышленной биотехнологии. Объектом нашего исследования был холодноводный обитатель Северо-Западной части Тихого океана актиния Cnidopus japonicus. Актиинии, или Морские анемоны (Actiniaria) - отряд морских стрекающих из класса коралловых полипов (Anthozoa). Большинство актиний являются ядовитыми, в состав их яда могут входить фосфолипазы, цитолизины, нейротоксины, протеолитические ферменты или инигибиторы протеаз. Интерес к токсинам актиний обусловлен возможностью их применения в качестве инструмента исследования механизмов функционирования биологических мембран и их компонентов. Традиционные подходы скрининга биологически активных молекул включают в себя множество технически сложных этапов: получение фракции яда, дальнейшее изучение химического состава и свойств, определения структуры, поиск конкретной биологической функции белков. В нашем случае для скрининга мы использовали подход, основанный на NGS секвенировании транскриптома (RNA-seq cDNA). Такой подход позволяет в короткие сроки получить практически полное представление о кодирующей части транскриптома, освобождая от необходимости секвенированировать геном. При этом появляются возможности поиска целевых транскриптов, соответствующим белковым токсинам анемон. Кроме того возможен поиск как токсинов, гомологичных ранее изученным, так и возможных кандидатов в токсины с ранее неизвестной структурой. Предсказав возможные варианты белковых компонентов яда, эти данные можно дополнить (валидировать) масс-спектрометрическим анализом пептидного и белкового состава образца яда. Таким образом сочетание современных подходов в транскриптомике и протеомике позволяет открывать новые белковые токины и сужать круг возможных кандидатов в токсины, при минимальном расходе исходного материала и реактивов.
СТРЕССОВЫЙ ОТВЕТ MYCOPLASMA GALLISEPTICUM: АДАПТИВНАЯ РЕАКЦИЯ ИЛИ ИСПОРЧЕННЫЕ ТОРМОЗА.
Фисунов Г.Ю., Горбачев А.Ю., Мазин П.В., Ковальчук С.И., Бутенко И.О., Матюшкина Д.С., Побегуц О.В.
Лаборатория протеомного анализа
Бактерии класса молликут являются удобными модельными объектами для системных исследований в силу редукции генома и простоты организации всех клеточных систем. В настоящей работе мы провели картирование транскрипционных единиц в геноме M. gallisepticum включая промоторы, опероны и терминаторы, а также сайтов связывания рибосомы. Мы исследовали транскрипционный ответ M. gallisepticum на тепловой, гиперосмотический и окислительный стресс, а также изменения профиля транскрипции в процессе роста культуры. Также мы детально исследовали процесс трансляции в логарифмической фазе роста и в условиях теплового стресса. В результате мы идентифицировали 1061 промотор с 10% FDR. Консенсусная последовательность промотора M. gallisepticum TRTGTAWAATW6*R (* - сайт инициации транскрипции). Мы идентифицировали два типа терминаторов транскрипции в геноме M. gallisepticum. Один тип представляет собой внутренние терминаторы со шпилечной структурой. Другой тип не имеет выраженной шпилечной структуры. Мы провели поиск мотивов в 5’-UTR транскриптов M. gallisepticum, а также моделирование взаимодействие между 5’-UTR и 3’-концевой последовательностью 16S рРНК. В результате мы обнаружили, что наиболее полным сайтом связывания рибосомы является последовательность GAAAGGAGG, однако, обычно, сайт связывания рибосомы составляет 4-5 буков из этой последовательности. Хотя тепловой стресс приводит к значительным изменениям в профиле тотальной мРНК, на уровне протеома эти изменения практически не проявляются. Единственный значимо возрастающий белок – шаперон ClpB. Мы исследовали изменения в рибосомально-связанной фракции мРНК в тепловом стрессе. В результате мы установили, что изменения на уровне тотальной мРНК почти не отражаются на пуле рибосомально-связанной мРНК. Единственным сильным изменением является увеличение представленности мРНК clpB, что согласуется с протеомными данными.
Клеточные модели на базе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для исследования молекулярных механизмов дегенерации сетчатки глаза
Лагарькова М.А., Лебедин М.В., Богомазова А.Н., Киселев С.Л.
Лаборатория клеточной биологии.
Целью работы является разработка методов получения и использования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) для коррекции генетических дефектов, приводящих к заболеваниям сетчатки глаза, in vitro и лечения заболеваний сетчатки глаза. В ходе работы была найдена мутация в гене PRPH-2, которая наследуется по аутосомно-доминантному типу и вызывает болезнь в семье с наследственной макулодистрофией по типу болезни Штаргардта. Мы также разработали надежные протоколы дифференцировки ЭСК и ИПСК в клетки пигментного эпителия сетчатки и фоторецепторов, как двумерной системе, так и при культивировании в 3D системе. Гистологический, иммунохимический, и ПЦР-анализ показали, что трехмерные структуры, полученные из ЭСК, ИПСК от нормальных доноров и пациентов с макулодистрофией похожи на развивающийся при эмбриогенезе глаз.
Отдел биофизики
ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА У ПАЦИЕНТОВ С ОСТРЫМ КОРОНАРНЫМ СИНДРОМОМ
Азизова О.А., Сыркин А.Л., Быкова А.А., Асейчев А.В., Пирязев А.П., Бекман Э.М., Сергиенко В.И.
Лаборатория биофизических основ патологии
Известно, что оксидативный стресс играет ключевую при возникновении и развитии сердечно-сосудистых заболеваний и его интенсивность значимо возрастает ещё до клинических проявлений заболеваний. Поэтому измерение маркёров оксидативного стресса можно использовать для прогноза развития заболевания, оценки хода его течения, прогноза развития осложнений и оценки эффективности проводимой терапии. Цель работы состояла в том, чтобы исследовать прогностическую значимость показателей оксидативного стресса в плазме крови у больных с острым коронарным синдромом на фоне современных подходов к лечению этого состояния. Основной задачей исследования было выявление показателей оксидативного стресса и сроки их определения наиболее информативные для оценки прогноза у больных с ОКС. Нами было обнаружено, что у пациентов с низкой кобальт-связывющей способностью (КССА) с ОП > 0,4135 ед. опт. пл./мл в первые сутки после поступления достоверно чаще наблюдался рецидив инфаркта миокарда (р=0,036). У пациентов с низким содержанием ОКА (общая концентрация альбумина, определенная с помощью флуоресцентного зонда К-35) < 33,6 г/л в первые сутки после поступления достоверно хуже проходит течение заболевания (р=0,011). Через 7 дней после поступления у пациентов с МДА > 112,12 нмоль/мл после медь-индуцированного окисления плазмы достоверно чаще отмечены рецидивы инфаркта миокарда (р=0,016). При уровне миелопероксидазы на 7 день от поступления выше 42,4 нг/мл относительный риск неблагоприятного течения болезни составляет 1,81 (95% ДИ 0,35 – 3,27; p=0,015). Таким образом, показатели КССА и МДА являются предикторами рецидива инфаркта миокарда. А показатели ОКА и уровень МПО являются предикторами неблагоприятного течения заболевания: смерть от инфаркта, рецидив инфаркта, постинфарктная стенокардия, экстренная реваскуляризация.
роль αC доменов в образовании фибриновых волокон по данным атомно-силовой микроскопии высокого разрешения
Протопопова А.Д., Баринов Н.А., Клинов Д.В.
Лаборатория медицинских нанотехнологий
Фибриноген – один из ключевых белков системы свертывания крови. Он является классическим объектом для исследований методами просвечивающей электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа. Однако до сих пор не удалось получить полную атомарную структуру молекулы фибриногена. Это обусловлено тем, что в составе фибриногена есть два крупных неструктурированных и подвижных участка – αC области – которые не видны в кристаллах с помощью рентгено-структурного анализа. На сегодняшний день также не понятны функции этих участков белка при свертывании крови.
Нам удалось при помощи микроскопии высокого разрешения впервые визуализировать αC области одновременно с полной доменной структурой фибриногена. Было обнаружено, что при pH 7.4 у большинства концевых D доменов молекул имеются один или два отростка средней длиной 21 ± 6 нм и высотой 0,4 ± 0,1 нм.
Благодаря беспрецедентно высокому разрешению полученных АСМ-изображений, впервые был визуализирован комплекс фибриногена с тромбином, получены изображения растущих фибриновых волокон с отчетливо видимыми αC областями входящих в них молекул.
Было обнаружено, что вблизи точек ветвления волокон, αC области переплетаются и, возможно, обеспечивают соединение соседних протофибрил на этапе утолщения волокон. Мы также наблюдали, образование коротких однотяжевых ассоциатов молекул, соединенных αC областями. Подобные однотяжевые структуры ранее не были описаны в литературе.
КИНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАЛОГЕНИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ
Панасенко О.М., Соколов А.В., Костевич В.А., Власова И.И.
Лаборатория физико-химических методов исследования и анализа
Миелопероксидаза (MПO, К.Ф. 1.7.1.11, донор: H2O2-оксидоредуктаза) является перспективной мишенью для коррекции развития воспалительной реакции организма, ассоциированной с окислительным/галогенирующим стрессом. Описан новый кинетический метод определения галогенирующей активности MПO. Метод основан на измерении скорости катализируемого иодидом окисления целестинового синего (ЦС) хлорамином (бромамином) таурина, образующимся при реакции таурина с гипохлоритом (гипобромитом), продуцируемым MПO. Установлено, что ЦС не является пероксидазным субстратом MПO. Доказано, что измерение скорости обесцвечивания целестинового синего в системе, содержащей МПО, хлорид (бромид), пероксид водорода, таурин и иодид, адекватно характеризует галогенирующую активность фермента. Получен коэффициент молярной экстинкции – 15200 М-1·см-1, позволяющий рассчитать скорость образования активных форм галогенов. Изучена зависимость активности MПO от ее концентрации, концентрации ее субстратов (пероксида водорода, хлорида, бромида), ингибиторов, катализатора (иодида), таурина и pH среды. Сравнение результатов выявления активных форм галогенов новым методом с традиционными методами определения галогенирующей активности МПО показало, что новый метод обладает наибольшей предельной чувствительностью. Использование нового метода подтвердило высокую ингибирующую способность церулоплазмина, как природного ингибитора МПО. Разработанный метод позволяет измерять галогенирующую активность МПО в кинетическом режиме и проводить скрининг потенциальных ингибиторов галогенирующей активности фермента.
Отдел клинико-экспериментальный
Состояние системы гемостаза после ранней отмены фондапаринукса у больных, госпитализированных с острым коронарным синдромом без стойких подъемов сегмента ST и имевших низкий риск неблагоприятного исхода
Князев А.С., Явелов И.С., Добровольский А.Б., Грацианский Н.А.
Лаборатория клинической кардиологии
Актуальность. Антикоагулянты являются одним из компонентов раннего лечения острого коронарного синдрома без стойких подъемов сегмента ST на ЭКГ (ОКСбпST) и после их преждевременной отмены описана реактивация процессов тромбообразования. Наряду с этим есть свидетельство, что при достаточно низком риске неблагоприятного исхода препараты этой группы клинической пользы не приносят. Цель работы – оценить состояние системы гемостаза при ранней отмене фондапаринукса у данной категории больных.
Материал и методы. В проспективное несравнительное исследование включено 53 больных, экстренно госпитализированных в первые 48 (медиана 2,3) ч после ангинозного приступа. Во всех случаях сумма баллов по шкале GRACE составляла ≤108, не был повышен сердечный тропонин T (≤0,03 нг/мл) и отсутствовали смещения сегмента ST ≥0,1 мВ. Все больные в стационаре получили ацетилсалициловую кислоту и бета-адреноблокаторы; клопидогрел использовался в 35 случаях. После единственной подкожной инъекции фондапаринукса антикоагулянты не использовались. На пике действия фондапаринукса и в период существенного ослабления его эффекта (медиана времени заборов крови 18,0 и 42,5 ч после инъекции) в плазме крови определяли концентрацию комплексов тромбин-антитромбин (ТАТ), плазмин-антиплазмин (ПАП) и Д-димера (ДД). Одновременно осуществляли холтеровское мониторирование ЭКГ (ХМ) в 12 отведениях как минимум в течение 36 часов (медиана начала после инъекции фондапаринукса 21,2 ч, медиана продолжительности 38,7 ч). Клинические исходы оценивали за время госпитализации (медиана 14 дней).
Результаты. После прекращения лечения фондапаринуксом концентрации комплексов ТАТ, ПАП и ДД увеличились: медианы 3,1 и 3,3 нг/л (p=0,002), 471 и 498 нг/л (p=0,052), 359 и 486 нг/л (p=0,002), соответственно. Ишемические смещения сегмента ST при ХМ отмечены у 13 больных (24,5%). Уровни ТАТ, ПАП, ДД и их изменения не были связаны с наличием ишемии миокарда, выявленной при ХМ. В период госпитализации случаев развития инфаркта миокарда и летальных исходов не было; у 3 больных зафиксированы приступы стенокардии.
Выводы. В небольшом “пилотном” исследовании при ранней отмене фондапаринукса у больных, госпитализированных с ОКСбпST и имевших низкий риск неблагоприятного исхода, в период существенного ослабления воздействия антикоагулянта имелись лабораторные признаки реактивации тромбообразования, которые не были сопряжены с возникновением ишемии миокарда.
НЕНОРМАЛЬНЫЕ ЛИПИДЫ У ДЕТЕЙ С РОДИТЕЛЬСКОЙ РАННЕЙ КОРОНАРНОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА. АССОЦИАЦИИ С ХАРАКТЕРИСТИКАМИ ИХ РОДИТЕЛЕЙ БЕЗ КОРОНАРНОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА
Коннов М.В., Деев А.Д.
Лаборатория клинической кардиологии
Ранее мы сообщали, что в семьях больных с ранней коронарной болезнью сердца (КБС) уровни факторов риска (ФР) детей разного возраста могут быть ассоциированы с характеристиками как родителя-пробанда, так и его/её супруга. Цель настоящей работы – отдельный анализ связи характеристик лиц без КБС - супругов пробандов - с ненормальными уровнями липидов их детей. Материал. Использованы данные обследования 200 супругов пробандов (16.8% мужчин) и 268 их детей 5-34 лет. Определения. Ненормальные уровни липидов: у детей 5-17 лет – низкий ХС ЛВП ≤25, высокие ТГ, ХС ЛНП ≥90 перцентили (Исследование Липидных Клиник); у детей 18-34 лет – низкий ХС ЛВП <1.0 (мужчины) или <1.3 (женщины), высокие ТГ ≥1.7, ХС ЛНП >3.36 ммоль/л. Метаболический синдром (MС) - JIS критерии. Метод. Связи изучены логистической регрессией в двух группах детей (5-17, n=127, 18-34 лет, n=141). Результаты. Независимыми родительскими предикторами высокого ХС ЛНП были: у детей 5-17 лет ХС ЛНП (ОШ 3.07, 95%ДИ 1.51-6.26, р=0.002), некурение (3.36, 1.13-10.0, 0.030), у детей 18-34 лет МС (2.63, 1.26-5.50, 0.010), ХС ЛНП (1.59, 1.05-2.42, 0.029); низкого ХС ЛВП у детей 18-34 лет – МС (4.15, 1.93-8.93, 0.0003), частота сердечных сокращений (ЧСС, уд/мин) (0.94, 0.90-0.98, 0.004); высоких ТГ у детей 5-17 лет – МС (6.27, 1.70-23.2, 0.006), ЧСС (1.10, 1.04-1.16, 0.0015), ХС ЛНП (2.24, 1.00-5.02, 0.049). Заключение. Обнаружены ассоциации характеристик родителей без КБС, прежде всего МС, с ненормальными уровнями липидов у их детей. Ассоциация с МС выявлена в обеих возрастных группах. Это предполагает особую роль родительского МС в формировании дополнительных (к семейной КБС) ФР у детей и указывает на важность обследования обоих родителей для лучшей стратификации риска у детей лиц с ранней КБС.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ГЛИКИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА В ПРОШЛОМ У ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ АССОЦИИРОВАНО С ЕГО БОЛЕЕ ПОЛНОЦЕННЫМ ЛЕЧЕНИЕМ
Эрлих А.Д., Ткаченко К.Г., Грацианский Н.А.
Лаборатория клинической кардиологии
ПРЕДПОСЫЛКИ. Согласно современным международным руководствам в качестве контроля за лечением СД необходимо определять уровень гликированного гемоглобина (HbA1c), а препаратами первого ряда должны быть метформин и инсулин.
ЦЕЛЬЮ работы было выявление связи информированности пациентов об определении у них HbA1c в прошлом с особенностями лечения СД.
МЕТОДЫ. В работе проанализированы пациенты, госпитализированные в ГКБ № 29 г. Москвы, и включённые в два однодневных скрининга (май и сентябрь 2014г.). В ходе каждого из скринингов регистрировались демографические, анамнестические данные у пациентов с СД, находящихся в стационаре на день проведения скрининга (в том числе, информированность об определении HbA1c в прошлом), а также препараты для лечения СД и уровень глюкозы крови на момент поступления в стационар.
РЕЗУЛЬТАТЫ. В ходе двух однодневных скринингов зарегистрированы данные у 95 пациентов с СД в анамнезе (9% от всех, лежащих в стационаре). Тридцать три пациента (35%) сообщили, что в прошлом у них определяли уровень HbA1c, а 62 пациентов (65%) отрицали определение у них уровня HbA1c, или не знали об этом. Выявлено, что пациенты, которым в прошлом определяли HbA1c при сравнении с остальными пациентами, достоверно чаще до госпитализации использовали любые гипогликемические препараты – 94% vs 68% (р=0,009), а также достоверно чаще лечились инсулином – 39% vs 16% (р=0,02). Среди пациентов, которые не лечились инсулином, пациенты, знающие о своём уровне HbA1c, достоверно чаще применяли в прошлом метформин – 55% vs 29% (р=0,04). Пациенты, которые сообщили, что у них ранее определяли уровень HbA1c, достоверно реже использовали препараты сульфанилмочевины – 29% vs 62% (р=0,011). Кроме того, среди пациентов, госпитализированных в кардиологические отделения было достоверно меньше тех, кому ранее определяли уровень HbA1c – 23% vs 44% (р=0,03).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ. В ходе исследования, организованного как серия однодневных скринингов, выявлено, что пациенты, сообщившие, то у них ранее определяли, получали более полноценное лечение СД, более близкое к рекомендованному современными руководствами: чаще получали медикаментозное лечение, в том числе, инсулином или метформином. Доля пациентов, отрицавших определение HbA1c в прошлом, оказалась очень высокой (65%!).
ВЛИЯНИЕ пептидов тимуса на экспрессию гена c-fos в РЯДЕ СТРУКТУР МОЗГА крыс
Крючкова А.В., Логинова Н.А., Белова О.В., Москвина С.Н., Зимина И.В., Иноземцев А.Н., Арион В.Я., Лосева Е.В.
Лаборатория молекулярной иммунологии и биохимии
Ранее было показано, что пептиды тимуса, помимо влияния на иммунную систему, влияют также и на высшую нервную деятельность: обладают мнемотропными, ноотропными, стресспротекторными и аналгетическими свойствами.
С целью изучения механизма действия пептидов тимуса было исследовано их влияние на функциональное состояние ряда структур мозга крыс. В качестве препарата сравнения был взят стандартный ноотроп пирацетам. Для изучения состояния клеток мозга оценивали уровень экспрессии раннего гена c-fos.
Работа проводилась на 3-х группах крыс-самцов линии Wistar (n = 5 в каждой). Животным в течение 15 дней водили внутрибрюшинно: физиологический раствор, пептиды тимуса (0,4 мг/кг) и пирацетам (300 мг/кг). Фронтальные срезы мозга окрашивали по стандартной иммуногистохимической методике. Проводили визуально-ранговый анализ площади и интенсивности свечения в двадцати одной структуре мозга на уровнях -2,52 мм от брегмы и +0,95 мм от брегмы (Paxinos, Watson, 2005).
Было выявлено, что введение пептидов тимуса вызывало увеличение площади и/или интенсивности свечения относительно контроля в латеральных ядрах септума, прилежащем ядре, зубчатой фасции, вентромедиальных и латеральных ядрах гипоталамуса, и снижение – в поле СА1 гиппокампа. Введение пирацетама увеличивало экспрессию гена c-fos относительно контроля в безымянном веществе, центральных ядрах септума, зубчатой фасции, дорсомедиальных, вентромедиальных и латеральных ядрах гипоталамуса, и уменьшало – в пириформной коре на уровне -2,52 мм от брегмы. В моторной коре, безымянном веществе, пириформной коре на уровне +0,95 мм от брегмы, дорсомедиальных и вентромедиальных ядрах гипоталамуса площадь и/или интенсивность свечения при введении пирацетама была статистически значимо больше, а в зубчатой фасции – меньше, чем при введении пептидов тимуса. В оставшихся 9-и структурах статистических отличий по экспрессии гена c-fos между группами показано не было.
Итак, различное воздействие пептидов тимуса и пирацетама показано в 11-и структурах мозга из исследованных 21-й. Тем самым показано специфичное нейротропное влияние пептидов тимуса, по исследованным показателям сравнимое с влиянием стандартного ноотропа пирацетама, но не идентичное с ним.
НАРУШЕНИЕ ПРОТИВОВИРУСНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ МИАЛГИЧЕСКОМ ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТЕ/СИНДРОМЕ ХРОНИЧЕСКОЙ УСТАЛОСТИ, АССОЦИИРОВАННОМ С ВИРУС ЭПШТЕЙНА-БАРР
Малашенкова И.К., Крынский С.А., Огурцов Д.П., Добровольская Е.И., Гурская О.Г., Жарова М.А., Зуйков И.А., Ледов А.В., Дидковский Н.А.
Лаборатория клинической иммунологии
Миалгический энцефаломиелит (МЭ) характеризуется повышенной частотой герпесвирусной инфекции и повышенной репликацией герпесвирусов, а также изменениями Th1-иммунного ответа [1]. Обследованы 62 больных МЭ (34 муж., 28 жен., средний возраст 34±5 лет) и 42 здоровых добровольца в качестве контрольной группы (14 муж., 28 жен., средний возраст 32,3±4,7 лет). Изучалась вирусная нагрузка в слюне методом количественной ПЦР (вирус Эпштейна-Барр, герпесвирус человека 6 типа, герпесвирус человека 7 типа) и уровень цитокинов в сыворотке методом ИФА (IFNα, IFNγ, IL-2, IL-10, IL-15). Применяли t-критерий Стьюдента и коэффициент корреляции Пирсона r; различия между группами считали достоверными при p<0.05. По результатам исследования, пациенты с МЭ имели более низкий уровень IFNα (p = 0.003), TNFα (p=0.0003), IL-15 (p=0.02). У них также отмечалась тенденция к более низкому уровню IFNγ (p=0.053). Кроме того, в группе пациентов с МЭ была отрицательная корреляция между IFNγ и уровнем EBV (r= -0.35), между IL-2 и уровнем EBV (r= -0.44), между IL-15 и уровнем EBV (r= -0.59). В контрольной группе корреляции EBV с уровнем цитокинов не было. В группе больных СХУ мы провели оценку уровня IFNγ и IL-2 в зависимости от репликации EBV. Уровень IFNγ и IL-2 был достоверно ниже при высокой (>104/мл) репликации EBV (p=0.037 и p=0.07). Снижение вирусной нагрузки в ходе терапии повышало продукцию ЦК Th1, подавление репликации вируса приводило к нормализации этих параметров. Полученные данные подтверждают нарушение Th1-ответа на герпесвирусную инфекцию при МЭ и демонстрируют возможности неинвазивной оценки репликации герпесвирусов у пациентов с МЭ.